高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析中的差示掃描熒光法(Differential Scanning Fluorimetry，DSF)是一種基于蛋白質(zhì)熱變性過程的熒光檢測方法。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是生物技術(shù)藥物重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，它決定了生物藥物的藥效、生產(chǎn)可行性、安全性及保質(zhì)期。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性確保了蛋白質(zhì)在其貨架壽命期內(nèi)保持活性和安全。
穩(wěn)定性研究被用來確認(rèn)蛋白質(zhì)在不同條件下高級結(jié)構(gòu)HOS(High Order Structure)的穩(wěn)定性，如溫度、pH值、輔料成分及儲存時間等，以確定適宜的存儲和運(yùn)輸條件。同時，監(jiān)管機(jī)構(gòu)如FDA、EMA等在授權(quán)生物藥使用批準(zhǔn)之前也要求廣泛的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。因此，理解和確保治療性蛋白質(zhì)藥物的高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是生物制藥企業(yè)開發(fā)安全有效藥物的必要條件，研究人員需要在研發(fā)和生產(chǎn)的多個階段對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行分析和評估。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常見分析方法
蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性分析通常會使用以下方法進(jìn)行研究：
生化方法
圓二色譜(CD，Circular Dichroism Spectroscopy)
差示掃描量熱法(DSC)
定量PCR(qPCR)技術(shù)(外源熒光DSF)
動態(tài)光散射(DLS)與靜態(tài)光散射(SLS)方法
差示掃描量熱法(DSC)法常常被做為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析最重要的的解決方案，然而，由于對儲存于微孔板(如96或384孔板)上的大量樣品的快速分析需求，使得DSC在藥物篩選和早期開發(fā)中的應(yīng)用受到一定的限制。因此，DSF(內(nèi)源熒光法)已成為一種流行且具有成本效益的解決方案。
DSF(內(nèi)源熒光法)無需對待測樣品進(jìn)行任何標(biāo)記，也無需使用任何熒光探針，即可快速測量整塊樣品微孔板，并提供高通量數(shù)據(jù)以幫助樣品候選物和配方成分的篩選。
DSF法快速篩選大量樣品，大大提高了藥物篩選、成藥性分析的效率，分析結(jié)果與DSC技術(shù)互相正交驗(yàn)證。對很多生物技術(shù)藥物而言，利用DSF方法做為快速大量篩選，使用DSC技術(shù)來正交驗(yàn)證DSF的早篩結(jié)果，是藥物篩選和藥物開發(fā)的一個有效方案。
DSF在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，包括但不限于以下幾個方面：
蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性檢測：大多數(shù)蛋白質(zhì)對溫度具有嚴(yán)格的要求，蛋白熱穩(wěn)定性的評估有助于蛋白功能的正常表達(dá)。DSF不僅可以高通量測定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定參數(shù)，而且還能評估突變、pH、離子強(qiáng)度等因素對熱穩(wěn)定性的影響，并從中篩選出可以提高熱穩(wěn)定性的因素。
蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑的高通量篩選：通過對化合物配體庫進(jìn)行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結(jié)合的候選化合物，評估化合物對蛋白穩(wěn)定性的影響，從而篩選出蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。
蛋白質(zhì)作用機(jī)制研究：如蛋白-蛋白互作研究，新發(fā)現(xiàn)蛋白藥物的親和動力學(xué)分析，蛋白與配體、輔助因子、分子伴侶結(jié)合的熱穩(wěn)定性參數(shù)測試。
小分子化合物抑制機(jī)制研究：利用DSF可以進(jìn)行高通量、矩陣式的多種化合物檢測(化合物與一些已知的抑制劑、底物、產(chǎn)物或輔助因子等結(jié)合)，用于小分子化合物抑制劑的篩選及其藥理機(jī)制的研究。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究：蛋白質(zhì)結(jié)晶是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個非常重要的手段，利用DSF可以高通量篩選蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件。
DSF技術(shù)原理：
差示掃描熒光法(DSF)是一種經(jīng)濟(jì)高效且易于使用的生物物理技術(shù)，它通過檢測當(dāng)溫度升高或變性劑存在時熒光發(fā)射光譜的相應(yīng)變化來確定蛋白質(zhì)的變性轉(zhuǎn)變溫度(熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值或化學(xué)變性Cm值)。
研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時(如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內(nèi)源熒光的最大發(fā)射光譜會發(fā)生位移。蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸內(nèi)源熒光強(qiáng)。
以色氨酸為例，在蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)核微環(huán)境中，其內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長在330nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長則出現(xiàn)在350nm左右。蛋白質(zhì)熱變性或者化學(xué)變性通常會導(dǎo)致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導(dǎo)致內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域移動。
這種監(jiān)測色氨酸內(nèi)源熒光變化的方法無需熒光探針或者標(biāo)簽，避免了傳統(tǒng)外源熒光DSF中背景熒光以及非特異吸附等假陽性結(jié)果。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)由于熱變性或者化學(xué)變性劑(如鹽酸胍、尿素等)作用而發(fā)生去折疊時，測量內(nèi)源熒光隨溫度或者變性劑的變化來就可以研究蛋白質(zhì)的展開過程。這些變化的數(shù)據(jù)可以用于生成熔解曲線，并獲取表觀熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值、Tonset、范德華焓變(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)、化學(xué)變性Cm值等用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的評估和預(yù)測。
傳統(tǒng)DSF經(jīng)常使用350/330比值法來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，而SUPR-DSF提供了多種分析方法，除了比值法外，SUPR-DSF還提供了BCM(Barycentric mean,質(zhì)心均值法)，可以得到比350/330比值法更好的信噪比，同時更有利于低濃度蛋白樣品的分析。
高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)主要特點(diǎn)：
采用標(biāo)準(zhǔn)的384微孔板，無需特殊的耗材和毛細(xì)管
高通量篩選，一個升溫過程(60-80分鐘)內(nèi)可完成
單塊384微孔板的測試?yán)脙?nèi)源熒光，無需染料或標(biāo)簽，兼容常用生物體系UV LED激發(fā)配合全光譜檢測
僅需要10-30μl樣品，樣品濃度0.05~250mg/mL
獲得關(guān)鍵參數(shù)：Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及親和力等
提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)質(zhì)量和可重復(fù)性
SUPR-DSF系統(tǒng)的應(yīng)用：
SUPR-DSF系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)等多個領(lǐng)域：
加速突變體的篩選
配方和預(yù)配方的篩選和優(yōu)化
蛋白結(jié)晶條件篩選
批間一致性評估
生物相似性評估
加速應(yīng)力和強(qiáng)制降解研究
結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化分析
翻譯后修飾評估
恒溫和化學(xué)穩(wěn)定性分析
高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)的技術(shù)規(guī)格：
典型應(yīng)用案例--加速突變體的篩選
使用SUPR-DSF對16個樣品進(jìn)行比較和篩選，其中包括1個野生型蛋白(WT)和15個單點(diǎn)突變體。在1.5小時內(nèi)，DSF儀器生成了48個樣本(每組3次重復(fù))的高質(zhì)量熔解曲線(相同時間內(nèi)最多可生成384孔的數(shù)據(jù))。用模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可獲取熔解溫度Tm值并對穩(wěn)定性進(jìn)行排序和篩選。
如圖1所示，與WT(藍(lán)色)相比，其中3個突變體(9、13和14)的熔解曲線左移，說明其蛋白穩(wěn)定性降低；余下12個突變體的穩(wěn)定性均有所提高。其中，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提升最大。
圖2展示了幾個代表性樣本的熔解曲線，可以發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)發(fā)生了單一熱轉(zhuǎn)變過程(WT蛋白與突變體7和8)，而另一些蛋白質(zhì)(突變體1和14)則清楚地顯示出兩段熱轉(zhuǎn)變過程，即熔解曲線上有兩個拐點(diǎn)。通過SUPR-DSF提供的數(shù)據(jù)，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進(jìn)行深入研究。
精確解析單抗的Fab區(qū)域
使用SUPR-DSF獲得NISTmAb(NIST單抗標(biāo)準(zhǔn)品)的差示掃描熒光數(shù)據(jù)，并將結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。SUPR-DSF可以解析NISTmAb所有的三個結(jié)構(gòu)域:CH2(69°C)，CH3(83°C)，和Fab區(qū)域(94°C)。SUPR-DSF的最高掃描溫度為105°C，可以精確測量異常穩(wěn)定的Fab區(qū)域熔解溫度，而其他DSF平臺的掃描最高溫度一般僅為95°C，容易丟失單抗Fab區(qū)域去折疊變性的重要信息(圖5(a))。
將SUPR-DSF歸一化后的數(shù)據(jù)與DSC結(jié)果進(jìn)行比較。如圖5(b)所示，三個峰相互匹配，證明了兩種技術(shù)良好的一致性，使用SUPR-DSF可以輕松獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性信息。
典型應(yīng)用案例--加速曲妥珠單抗的輔料和配方篩選
生物治療藥物如抗體等的配方是保證藥效、生產(chǎn)可行性和安全性的基礎(chǔ)，也決定了儲存和運(yùn)輸?shù)臈l件。制藥企業(yè)亟需高通量的方法來快速可靠地篩選大量的條件組合，以確定最佳配方。
使用SUPR-DSF，研究者對治療性抗體曲妥珠單抗在96種不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了篩選和分析，并在1.5小時內(nèi)完成了測試。測試結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)的結(jié)果非常一致。如果集成實(shí)驗(yàn)室自動化設(shè)備，每天可以完成數(shù)千個樣品的篩選。
DSF熔解曲線顯示出兩個獨(dú)立的轉(zhuǎn)變區(qū)域，通過最小二乘法對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可以確定Tonset值、Tm值和范德華焓變(△H)。圖3(a,b)分別展示了破壞/增強(qiáng)穩(wěn)定性的輔料的熔解曲線及擬合圖。圖4(a)列出了能夠提高抗體穩(wěn)定性的所有輔料(與對照樣品相比)。
SUPR-DSF正確鑒別了已上市的曲妥珠單抗中使用的輔料組氨酸和海藻糖的穩(wěn)定性作用，如圖4(b)所示，SUPRDSF數(shù)據(jù)具有出色的可靠性和一致性，同時提供驚人的高通量。
利用高通量差示掃描熒光法獲得結(jié)合參數(shù)
結(jié)合分析研究是藥物研發(fā)的一個關(guān)鍵領(lǐng)域，相互作用的特征和KD值(解離平衡常數(shù)，表征分子間結(jié)合的親和力)對候選物的選擇是至關(guān)重要的，研究者需要采用多種原理互補(bǔ)的方法來篩選和確定文庫中的數(shù)千種至數(shù)萬種小分子化合物。
通過SUPR-DSF進(jìn)行分子相互作用分析，不受表面效應(yīng)、物質(zhì)遷移(mass transport)或緩沖液折光率問題等因素的影響，可在分析物結(jié)合濃度范圍內(nèi)提供高通量、無需標(biāo)記的測量。
通過檢測蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性變化，可用于確認(rèn)結(jié)合的特異性；通過熱變性時熒光發(fā)射光譜的變化和配體濃度的函數(shù)關(guān)系可以計算KD值。即使對于非常弱的結(jié)合分子，結(jié)合所誘導(dǎo)的穩(wěn)定性變化也能被SUPR-DSF檢測到。
使用標(biāo)準(zhǔn)384微孔板，能夠在一天內(nèi)篩選數(shù)千個樣品的穩(wěn)定性，從而確認(rèn)結(jié)合狀態(tài)。
使用SUPR-DSF研究配體(TFMSA)與人碳酸酐酶I的結(jié)合作用，碳酸酐酶隨TFMSA濃度變化的熔解曲線如圖6所示。
圖7顯示了人碳酸酐酶I的Tm值與TFMSA濃度的關(guān)系，擬合所獲得的KD值有兩個，分別為2.1μM和174.2μM，與
文獻(xiàn)中的數(shù)值一致，證明SUPR-DSF可以用作配體結(jié)合研究的預(yù)篩選或確認(rèn)工具，并且具有靈敏度。
直觀簡明的軟件
SUPR-DSF軟件提供直觀、簡潔、智能、高效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計與數(shù)據(jù)分析功能，既可以讓初學(xué)者快速上手，又可為經(jīng)驗(yàn)豐富的資深用戶提供多種進(jìn)階選項(xiàng)。
關(guān)于ProteinStable
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